Nature methods | 美国加利福尼亚生物研究所引导CrY2H-seq新技术实现大规模、多复用的深度覆盖互作网路绘图

美国加利福尼亚Salk生物研究所团队，基于酵母双杂交和二代高通量测序的高效绘制大规模，多复用的蛋白互作网络图，相关成果以“a massively multiplexedassay for deep-coverage interactome mapping”为题在Nature methods 上发表。

研究背景：

酵母双杂交实验是目前z为广泛使用的绘制蛋白互作的方法之一，可以帮助科研工作者鉴定目的蛋白涉及的相关互作网络，丰富蛋白互作的资源库。但由于成本、时间、现有技术的的限制，大规模的蛋白相互作用网络图谱绘制是一项很大的挑战。一种大规模、多复用的深度覆盖互作网络绘制的实验方法（CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping）的出现为高通量大规模鉴定蛋白互作提供了可能。研究人员利用Cre重组酶作为Y2H蛋白互作报告因子，在细胞内通过特异识别蛋白编码序列的loxP位点，共价单向的连接互作的诱饵和捕获质粒。连接的蛋白编码序列充当互作识别DNA分子，结合二代高通量测序手段，实现了大规模、多重复的筛选蛋白互作网络的要求。

研究目的：

以酵母双杂体系为基础并结合二代测序技术，从而实现高通量大规模鉴定蛋白互作网络的目的。

研究结果：

美国加利福尼亚州索尔克生物研究所基因组分析实验通过改造酵母双杂AD和BD载体及转化酵母菌菌株，构建了可以利用DNA测序技术检测蛋白质互作结果的实验方法。

1、研究人员首先开发了一个携带由gal4诱导的GAL7::CRE表达盒和GAL1::HIS3和GAL2::ADE2缺陷营养表达盒酵母菌株CRY8930。然后，改造了一个广泛使用的ARS/CEN gateway兼容质粒，使其包含单向lox序列侧翼的ORF插入片段3 '端，这样在Cre重组时，两个ORF插入片段将以固定方向位于同一DNA分子上，这样就可以通过筛选在这些重组质粒的酵母转化子，从而鉴定相互作用的蛋白。

2、研究人员使用1,956个拟南芥转录因子为诱饵质粒，使用CrY2H-seq技术体系，筛选拟南芥酵母文库，通过测序分析共鉴定得到8577组相互作用的拟南芥转录因子互作网络。

3、对于上述结果，研究人员使用 AtTFIN-1进行互作验证，通过Michaelis–Menton 模型拟合曲线发现使用CrY2H-seq技术体系筛选到的互作蛋白的数量并没有达到饱和，仅有理论的54.6%，所以使用CrY2H-seq技术体系时需要进行多次筛选，综合多次筛选结果来提高实验的可信度。

4、选取检测到的AtTFIN-1互作频率多的3,086 个高置信度 AtTFIN-1 相互蛋白（2,578组新互作）研究其生物学意义。发现互作蛋白在生长素响应和不同激素和胁迫信号方面的巨大潜能。上述分析扩展的ARF–AUX–IAA互作模式，揭示了特定的如何在介导生长素反应和其他植物途径之间的串扰中发挥特定作用。