新一代同源建模AlphaFold 2技术的应用

文章标题：OsNRAMP5的弱等位基因在水稻中可以适度吸收镉，同时防止锰的缺乏。

01、研究背景

大米中的镉(Cd)是人镉摄入的主要来源。在与水稻Cd积累有关的几个基因中，OsNRAMP5功能的缺失可以通过抑制根系吸收而有效降低籽粒镉的浓度。但OsNRAMP5也是一个主要的锰转运体，因此选育不引起子粒严重缺锰的情况下降低籽粒Cd浓度的水稻品种十分重要。

02、研究目的

文章鉴定了一个新的OsNRAMP5等位基因，其337位的谷氨酰胺(Q)被赖氨酸(K)取代，该等位基因表型为对缺锰表现出较强的抗性。通过在酵母细胞验证表明该突变位点是OsNRAMP5功能的关键位点之一。

03、研究结果

1> 通过对突变体进行鉴定，文章发现Q337K突变体1009碱基C被A取代，蛋白质中337位谷氨酰胺(Q)突变为赖氨酸(K)。表型鉴定显示Q337K突变体适度降低Cd和Mn含量，Q337K还未完全丧失OsNRAMP5的功能。结果表明Q337K是一个弱OsNRAMP5等位基因。

2> 通过将Q337K等位基因转化到Cd转运液泡缺陷的酵母菌株Δycf1和Mn吸收缺陷的酵母菌株Δsmf1中。在转化OsNRAMP5-Q337K的Δycf1酵母菌株在添加Cd后，酵母细胞生长要优于野生型。在转化OsNRAMP5-Q337K的Δsmf1酵母菌株，在添加螯合的Mn后，酵母细胞生长微弱相比较于野生型。所以Q337K等位基因在Cd和Mn的摄取上保留了OsNRAMP5较弱的功能。

3> 在Q337K突变体、敲除株系和野生型中，Q337K突变体缺Mn的表型要优于突变体。经过元素检测Q337K突变体和敲除株系茎部Fe浓度都较低，而在Mn水平较低的敲除株系中根部铁浓度显著高于野生型。而且Q337K突变体和敲除株系在Zn和Cu浓度上均表现出相对于野生型的差异，但其影响不像对Mn浓度的影响那么显著。

4> 在Cd处理条件下，野生型与Q337K突变体、敲除株系相比根和茎中的Cd含量明显更多，而且高Cd浓度处理会抑制了根对Mn的吸收和转运。但由于OsNRAMP5突变体蛋白功能较弱，Q337K突变体和敲除株系在高浓度Cd处理条件下Mn的浓度没有变化。

5> 在大田中Q337K突变体植株与种子性状与野生型和敲除株系无显著差异。但Q337K突变体子粒和秸秆中Cd含量要低于野生型，Mn含量要高于敲除株系。

6> 文章推测Q337K突变位点是OsNRAMP5蛋白功能结构域，因此通过点突变将Q337位点突变分别用18种氨基酸替换，并转入酵母菌Δycf1和Δsmf1中。结果表明，突变Q337位点不会改变蛋白对Cd和Mn的选择性，而且Q337K突变类型的蛋白活性在18种突变中是中等类型。

7> 为了探究Q337不同突变类型对酵母细胞金属敏感性的影响，文章使用基于深度卷积神经场(DeepCNF)的RaptorX-Property工具进行蛋白质二级结构预测，并利用TMHMM 2.0在线工具预测蛋白跨膜结构。结果发现，Q337的突变改变了OsNRAMP5的跨膜螺旋结构，表明Q337位点可能影响蛋白质的二级结构特性。最后使用AlphaFold 2预测OsNRAMP5蛋白的三维结构，并利用在线工具Dali服务器与DraNRAMP（6D91）和ScaNRAMP（4WGW）蛋白进行结构比较，发现OsNRAMP5与这两个蛋白具有较高的相似性，其中Q337临近的TMH8结构域含有有一段高保守序列，对维持蛋白形态和开关细胞具有重要作用，表明Q337在金属离子转运中发挥重要作用。

结论

虽然Q337位点引起的OsNRAMP5的构象变化有待进一步研究，但可以通过基因组编辑手段编辑OsNRAMP5中Q337的位点可以培育出具有不同金属转运活性的水稻植株。