酵母文库质检新篇章

文章标题：酵母双杂交文库高通量测序鉴定，提供了全新的酵母文库质量评价标准！

研究背景

酵母双杂交(Y2H)是研究生物中蛋白互作的经典方法，但存在假阳性比例高的特点限制了其广泛的应用。目前传统的文库鉴定方法仅通过鉴定文库的库容和片段的长度来判断酵母文库的质量，该鉴定方法存在随机性和单一性的问题。因此，开发一种新的文库鉴定方法来评价酵母文库的质量对于酵母双杂体系的进一步应用具有重要的意义。

研究目的

本文开发了一种新的方法来评估文库，只需要构建一个10 ng的文库，通过15次PCR扩增插入片段，然后进行高通量测序。该方法消除了传统方法的随机性和单一性，同时可获得插入基因数量、基因丰度等关键指标，可有效评价文库的质量。

技术路线

研究结论：

1、传统的库容鉴定方法是将50 μL菌液稀释1000倍后涂LB平板并过夜培养，通过平板上的单克隆数来计算构建文库的库容；而插入片段的长度和重组率是在过夜平板中随机挑选24个单克隆进行PCR扩增和电泳检测，并观察扩增片段在300 ~ 2000bp之间的比率。

2、本研究开发新的鉴定方法是通过12、15、18次循环的PCR回收产物进行凝胶电泳，发现12和15次循环PCR产物的条带约为2000bp，而18次循环PCR产物的条带仅为1000bp左右。而且15次循环PCR纯化产物的样品添加量最低，但这些条带仍然是最亮。因此，5次循环的PCR产物质量最高，对上述的循环的PCR产物进行PE150的高通量测序，测序数据量不少于6G。

3、通过对不同循环数的PCR产物测序数据进行De Novo拼装，结果发现当PCR循环次数从12次增加到15次时，基因数、N50、中位数和平均长度均略有增加，但当循环次数增加到18次时，所有参数均急剧下降。因此，PCR循环数为15，扩增效率最好。根据基因丰度和均匀度分析，在12和15次循环周期中均无显著偏离PCR扩增，但在18次循环中观察到偏离，这与电泳图谱的结果一致。综上所述，15次循环为评价Y2H文库质量的最佳循环次数。

4、传统的酵母文库检测方法只能提供文库容量信息和非常有限的文库插入长度，不能有效评价文库质量。在新的检测方法中，仅使用了10 ng的文库质粒，通过高通量测序，获得了文库的插入基因数、基因丰度等关键指标。因此该方法可以有效地评价文库的质量。此外，新的文库质量评价方法还可以获得非模式物种的基因序列，为下一步克隆编码互作蛋白的基因提供信息。而且这种方法适用于任何类型的酵母文库。

交付标准：文库容量（E.coli）：≥1×10^7 cfu；重组率：≥90%；插入片断平均大于1kb。示例如下：